HPLC法黄芪活性多糖酶降解单因素试验

黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性主要物质,由于多糖结构难于精确测定,限制了黄芪多糖体内分子作用机制的深入研究。“多糖受体学说”认为免疫活性多糖分子中存在一种或多种寡糖片段“活性中心”,因此将黄芪多糖降解为寡糖,从寡糖水平研究多糖的活性中心,研究黄芪多糖结构及作用机制。

称取一定量黄芪活性多糖在酶浓度0.5U·min-1、酶解温度60℃、酶解时间1-2h条件下降解,酶解后立即置于沸水中灭活10min,离心取上清,冷冻干燥后得黄芪寡糖混合物,称取mg用水溶解,湿法上样,去离子水进行洗脱,通过2mL的管连续收集洗脱液,洗脱速度为层析柱中洗脱液下降速度5cm·h-1,收集60管,每隔5管进行高效液相色谱(HPLC)分析。

HPLC分析条件色谱柱:mm×4.6mm,5μm;检测器:ELSD;流动相:A-纯水,B-乙腈;梯度洗脱:0~55min,15%~50%A,85%~50%B;流速:1mL·min-1;柱温:35℃;进样量:20μL;ELSD漂移管温度℃;载气流速2.5L·min-1。

黄芪活性多糖酶降解单因素试验酶解产物中,寡糖聚合度由麦芽二糖~麦芽九糖标准品确定,如图所示,14min为麦芽二糖,20min为麦芽三糖,24min为麦芽四糖,28min为麦芽五糖,31min为麦芽六糖,34min为麦芽七糖,37min为麦芽八糖,38min为麦芽九糖,麦芽九糖之后聚合度依次增加。根据标准品保留时间可推测黄芪多糖酶降解后寡糖样品的聚合度大小。




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